Kiwango cha utakaso wa protini inahitajika inategemea matumizi ya mwisho ya protini.
Kwa baadhi ya programu, dondoo mbaya haitoshi. Hata hivyo, kwa matumizi mengine, kama vile vyakula na madawa, kiwango cha juu cha usafi kinahitajika. Ili kufikia hizi mbinu kadhaa za utakaso wa protini hutumiwa kawaida, katika mfululizo wa hatua za utakaso.
Kila hatua ya utakaso ya protini husababisha kiwango fulani cha kupoteza bidhaa. Kwa hiyo, mkakati bora wa utakaso wa protini ni moja ambayo ngazi ya juu ya utakaso hufikiwa katika hatua chache zaidi. Uchaguzi wa hatua ambazo unatumia hutegemea ukubwa, malipo, unyevu na mali nyingine ya protini inayolengwa. Mbinu zifuatazo zinafaa zaidi kwa kusafisha protini moja ya cytosolic. Utakaso wa complexes za protini za cytosolic ni ngumu zaidi na kwa kawaida inahitaji njia tofauti.
Hatua za Kwanza za Utakaso wa Protein
Hatua ya kwanza katika kusafisha intracellular (ndani ya seli) protini ni maandalizi ya dondoo isiyo ya kawaida .
Dondoo itakuwa na mchanganyiko tata wa protini zote kutoka kwenye kiini cha kiini, na baadhi ya macromolecules ya ziada, cofactors, na virutubisho. Dondoo isiyo ya kawaida inaweza kutumika kwa baadhi ya matumizi katika bioteknolojia, hata hivyo, ikiwa usafi ni suala, hatua zafuatayo za utakaso zifuatiliwe.
Extracts za protini zisizofaa zinatayarishwa na kuondolewa kwa uchafu wa seli zinazozalishwa na lysis ya seli, ambayo inapatikana kwa kutumia kemikali na enzymes , sonication au Press ya Kifaransa. Uchafu huondolewa kwa centrifugation, na supernatant inapatikana. Maandalizi yasiyofaa ya protini za ziada ya ziada yanaweza kupatikana kwa kuondoa tu seli kwa centrifugation.
Kwa maombi fulani ya kibayoteknolojia , kuna mahitaji ya enzymes zinazoweza kutengeneza: Enzymes ambazo zinaweza kuvumilia joto la juu bila kudhoofisha, na wakati wa kudumisha shughuli maalum. Wakati mwingine maumbile ambayo huwazalisha huitwa extremophiles. Njia rahisi ya kutakasa protini isiyozuia joto ni kutangaza protini nyingine katika mchanganyiko kwa kupokanzwa, halafu hupunguza ufumbuzi (hivyo kuruhusu enzyme inayoweza kutengeneza au kurekebisha, ikiwa ni lazima.) Protini zilizoharibika zinaweza kuondolewa kwa centrifugation.
Hatua za Usafi wa Kati
Katika siku za nyuma, hatua ya pili ya kawaida ya kutakasa protini kutoka kwa dondoo isiyokuwa ya udongo ilikuwa kwa ufumbuzi katika suluhisho na nguvu ya juu ya osmotic (yaani chumvi ufumbuzi). Dutu za nucleic katika dondoo isiyo ya kawaida zinaweza kuondolewa kwa kuzuia aggregates sumu na streptomycin sulfate au protamini sulfate.
Uharibifu wa protini hufanyika kwa kutumia sulfate ya amonia kama chumvi.
Proteins tofauti zitapungua kwa viwango tofauti vya sulfate ya amonia . Kwa ujumla, protini za kiwango cha juu cha uzito wa Masi katika viwango vya chini vya sulfate ya amonia. Mvua wa mvua haifai kuwa na protini iliyosafishwa sana lakini inaweza kusaidia kuondokana na protini zisizohitajika katika mchanganyiko na kuzingatia sampuli. Salts katika suluhisho huondolewa kwa dialysis kwa njia ya mizizi ya cellulose ya porous, filtration, au gel chromatography kuachwa.
Protoksi za kisayansi za kibayoteki mara nyingi zinatumia fursa nyingi za vifaa vya kibiashara ambavyo hutoa ufumbuzi tayari kwa taratibu za kawaida. Utakaso wa protini mara nyingi hutumiwa kwa kutumia filters na nguzo zilizowekwa za filtration za gel. Wote unapaswa kufanya ni kufuata maelekezo na kuongeza kiasi sahihi cha suluhisho sahihi na kusubiri muda uliojulikana wakati unakusanya kielelezo (kinachotoka upande mwingine wa safu) katika tube safi ya mtihani.
- Mbinu za Chromatographic zinaweza kutumiwa kwa kutumia nguzo za benchi au vifaa vya HPLC vya automatiska. Kugawanyika kwa HPLC kunaweza kufanywa kwa njia ya reverse-phase, kubadilishana-ioni au njia za kutengwa, na sampuli zilizoambukizwa na safu ya teknolojia au laser teknolojia. A
Visualization ya Protein na Tathmini ya Utakaso
- Chromatography ya awamu ya nyuma (RPC) hutenganisha protini kulingana na hidrophobicity zao. Mbinu hii inachagua sana lakini inahitaji matumizi ya vimumunyisho vya kikaboni. Baadhi ya protini zinaharibiwa kabisa na vimumunyisho na zitapoteza utendaji wakati wa RPC. Kwa hiyo njia hii haipendekezi kwa ajili ya matumizi yote, hasa ikiwa ni muhimu kwa protini ya lengo ili kuhifadhi shughuli.
- Chromatography ya kubadilishana ion inahusu kujitenga kwa protini kulingana na malipo . Nguzo inaweza kuwa tayari kwa ajili ya kubadilishana anion au kubadilishana cation. Amani ya ubadilishaji wa Anion yana awamu ya stationary na malipo mazuri ambayo huvutia protini za kushtakiwa vibaya. Nguzo za ubadilishaji wa cation ni suluhisho, kinyume cha kushtakiwa vibaya ambacho huvutia protini za kushtakiwa vyema. Uharibifu wa protini (s) ya lengo unafanywa kwa kubadilisha pH katika safu, ambayo husababisha mabadiliko au neutralization ya makundi ya kazi ya malipo ya kila protini.
- Chromatografia ya kuingizwa kwa ukubwa ( filtration ya gel ) hutenganisha protini kubwa kutoka kwa wadogo tangu molekuli kubwa husafiri kwa kasi kwa kutumia polymer iliyounganishwa msalaba kwenye safu ya chromatography. Proteins kubwa hazifanani na pores ya polymer ambapo protini ndogo hufanya, na huchukua muda mrefu kusafiri kupitia safu ya chromatography, kupitia njia yao ya chini. Eluate inakusanywa katika mfululizo wa mikojo inayojitenga protini kulingana na muda wa elution. Uchafuzi wa gel ni chombo muhimu kwa kuzingatia sampuli ya protini tangu protini ya lengo inakusanywa kwa kiasi kidogo cha elution kuliko kilichoongezwa awali kwenye safu. Mbinu za kufuta kufanana zinaweza kutumika wakati wa uzalishaji mkubwa wa protini kwa sababu ya gharama zao za ufanisi.
- Chromatography ya ushirika ni mbinu muhimu sana kwa "kupiga rangi" au kukamilisha mchakato wa utakaso wa protini. Sifa katika safu ya chromatography ni kuunganishwa na ligand ambazo hufunga hasa kwa protini inayolengwa. Protini huondolewa kwenye safu kwa kusafisha na suluhisho iliyo na ligands bure. Njia hii inatoa matokeo safi na shughuli maalum zaidi ikilinganishwa na mbinu nyingine.
- SDS-PAGE ni electrophoresis ya gel polyacrylamide, inayofanyika mbele ya SDS (sodium dodecyl sulphate) ambayo inafunga kwa protini kuwapa malipo makubwa ya net hasi. Tangu mashtaka ya protini zote ni sawa sawa, njia hii huwatenganisha karibu kabisa kulingana na ukubwa. SDS-PAGE ni mara nyingi hutumiwa kupima usafi wa protini baada ya kila hatua katika mfululizo. Kama protini zisizohitajika huondolewa hatua kwa hatua kutoka kwenye mchanganyiko, idadi ya bendi zilizoonyeshwa kwenye gel SDS-PAGE imepunguzwa, mpaka kuna bendi moja tu inayowakilisha protini inayotaka.
- Immunoblotting ni mbinu ya visualization ya protini iliyotumika kwa kuchanganya na chromatography ya ushirika. Antibodies kwa protini maalum hutumiwa kama ligands kwenye safu ya chromatography ya ushirika. Protini ya lengo ni kuhifadhiwa kwenye safu, kisha imeondolewa kwa kusafisha safu na suluhisho la chumvi au mawakala wengine. Antibodies zilizounganishwa na maabara ya mionzi au ya rangi ya misaada katika kutambua protini ya lengo mara moja ikitenganishwa na mchanganyiko wote.
Vyanzo:
Zubay G. 1988. Biochemistry, Toleo la 2. Macmillan Publishing Co, New York, NY, USA.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Kitabu cha Utakaso wa Protein, Toleo AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, Marekani. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.