Marekebisho kwa vipengele vingine vya mmenyuko wa polymerase ya mlolongo (PCR) yanaweza kubadilisha ubora wa matokeo, ama kwa kuboresha au kupungua kwa mazao ya bidhaa na ubora au kwa kuboresha ufanisi wa majibu na uelewa. Vigezo vinavyoathiri matokeo ya mwisho vinaweza kuwa kimwili (yaani, hali ya joto, nyakati za mzunguko) au kemikali (yaani template ukolezi, aina ya enzyme kutumika). Zifuatazo ni sababu kadhaa muhimu zinazoathiri mafanikio ya PCR.
01 Masharti safi ya Maabara
Kwa kuwa PCR ina uwezo wa kuchunguza molekuli moja ya DNA, ni muhimu kudumisha hali ya kawaida katika maabara. Daima kuvaa kinga mpya, kutumia glassware safi, zilizopo na vidokezo vya pipette na ufumbuzi mbaya, na kusafisha eneo la kazi kabla ya kuanza kazi.
Daima ni pamoja na athari za kudhibiti, bila DNA ya template na bila enzyme, ili kuhakikisha matokeo ni kwa sababu ya kukuza sampuli sahihi.
Watu wengi wanahakikisha kuwa na seti yao ya ufumbuzi ambayo haijashirikiwa kufanya matatizo rahisi na pipettes zilizochaguliwa mara nyingi huwekwa kando kwa PCR tu. Vipimo vya PCR vya DNase na RNase, vidokezo vya pipette ambavyo hazijumuishwa na aerosol na kufanya kazi kwenye hood ya moto kwa mwanga wa UV pia ni njia za kupunguza matatizo.
02 Components Kemikali
- Kuwa na msingi wa 18 hadi 24
- Usiwe na muundo wa sekondari (yaani, viungo vya hairpin)
- Kuwa na usambazaji wa usawa wa jozi za G / C na A / T
- Haiwezi kuingiliana kwa mwisho wa mguu wa 3
- Ina joto la kiwango (Tm) kuhusu digrii 5-10 Celcius chini ya joto la annealing, ambayo ni kawaida kati ya digrii 55 na 65 digrii
Tm kwa nyongeza zote lazima pia kuwa sawa na matokeo bora.
03 Mchanganyiko wa Mchanganyiko: Kigezo na Vitambulisho
Viwango vya thamani vya primer ni kati ya 0.1 na 0.6 micromoles / L. Kiasi cha template inatofautiana kulingana na aina ya DNA (binadamu, bakteria, plasmid).
Kwa kiasi cha chini sana cha template, kuna mikakati mingine ya kuboresha matokeo, kama namba za mzunguko zilizoongezeka au matumizi ya "kuanza kwa moto." Daima majaribio mapya kwa majibu ya kudhibiti udhibiti, kuwa na hakika wanafanya kazi chini ya hali yako maalum ya majaribio.
04 Mchanganyiko wa Mchanganyiko: Shughuli ya Enzyme
Mkusanyiko wa MgCl2 katika mchanganyiko wa mmenyuko unaweza kuathiri matokeo ya PCR na inaweza kuwa na jukumu muhimu katika athari zaidi ya kupendeza. Cation ya magnesiamu hufanya complexes zinazosababishwa na dNTPs ili kuzalisha substrate halisi ambayo inatambua enzyme ya polymerase.
Kiasi sawa cha dNTPs zote nne pia husaidia kupunguza kiwango cha makosa ya polymerase. Vipengee vingine kama vile betaine, BSA, sabuni, DMSO, glycerol, na pyrophosphatase pia vinaweza kuathiri maalum ya enzyme au ufanisi wa majibu.
05 Aina ya Thermocycler
Wakati wa ununuzi wa vifaa vya maabara, weka akilini kwamba baadhi ya thermocyclers si sahihi zaidi kuliko wengine katika kudumisha hali halisi, inayohitajika.
Hii ni sehemu moja ambapo bei ya bei nafuu haiwezi kulipa kwa muda mrefu unapokuwa unakabiliwa na mmenyuko wa dhahabu au kutumia vipindi ambavyo vinahitaji joto ndogo la annealing.
Vipimo vya majibu vyenye mviringo vinavyotengenezwa ili kuzingatia brand sahihi ya thermocycler unayotumia, pia kusaidia kuboresha joto la mmenyuko.
Mipangilio ya mzunguko wa 06
Kuongezeka kwa mavuno kunaweza kupatikana kwa kuongeza muda wa ugani kuhusu kila mzunguko wa 20, ili kulipa fidia kwa enzyme ndogo ili kuongeza template zaidi. Kawaida, mzunguko wa chini ya 40 ni wa kutosha ili kuimarisha molekuli chini ya 10 template kwa mkusanyiko mkubwa wa kutosha kuona juu ya gel ya ethidium bromide-stained agelose .