Je, PCR ina nini cha kufanya na DNA ya ufuatiliaji na kuenea kwa jeni
Mmenyuko wa mnyororo wa polymerase ( PCR ) ni mbinu za maumbile ya maumbile ya kufanya nakala nyingi za jeni na pia ni sehemu ya mchakato wa ufuatiliaji wa jeni.
Je, kazi ya Polymerase ya Mpangilio wa Kazi Inafanyaje?
Hati za Gene zinafanywa kwa kutumia sampuli ya DNA, na teknolojia ni nzuri ya kutosha kufanya nakala nyingi kutoka nakala moja ya jeni iliyopatikana katika sampuli. Kupanua PCR ya jeni kufanya mamilioni ya nakala, inaruhusu kugundua na kutambua utaratibu wa gene kutumia mbinu za kuona kulingana na ukubwa na malipo (+ au -) ya kipande cha DNA.
Chini ya hali ya kudhibitiwa, vikundi vidogo vya DNA vinatengenezwa na enzymes inayojulikana kama DNA polymerases, ambayo huongeza deoxynucleotides (dNTPs) kwa kipande cha DNA inayojulikana kama "template." Hata vipande vidogo vya DNA, ambavyo huitwa "primers" hutumika kama mwanzo wa polymerase. Vitambaa ni vipande vidogo vyenye binadamu vya DNA (oligomers), kwa kawaida kati ya nucleotides 15 na 30 kwa muda mrefu. Wao hufanywa kwa kujua au kubadili utaratibu mfupi wa DNA mwishoni mwa jeni kuwa imeongezeka. Wakati wa PCR, DNA iliyokuwa imetengana inapokanzwa na pande mbili hutofautiana. Juu ya baridi, vifungo vinamfunga kwenye template (inayoitwa annealing) na kuunda nafasi ya polymerase kuanza.
Mbinu ya PCR
Mchanganyiko wa mnyororo wa polymerase (PCR) uliwezekana kwa ugunduzi wa thermophiles na thermophilic polymerase enzymes (enzymes zinazoendelea uaminifu wa miundo na utendaji baada ya joto kwenye joto la juu).
Hatua zinazohusika katika mbinu za PCR ni kama ifuatavyo:
- Mchanganyiko umeundwa, pamoja na viwango vilivyopangwa vya template ya DNA, enzyme polymerase, primers, na dNTPs. Uwezo wa kuchanganya mchanganyiko bila kudhoofisha enzyme inaruhusu kudhoofisha helix mbili ya DNA sampuli kwa joto katika mbalimbali ya nyuzi 94 Celsius.
- Kufuatilia dalili, sampuli imefunuliwa kwa kiwango cha wastani zaidi, karibu na digrii 54, ambazo zinawezesha kuimarisha (kumfunga) kwa nyaraka za DNA moja iliyopigwa.
- Katika hatua ya tatu ya mzunguko, sampuli hurejeshwa kwa digrii 72, joto bora kwa Taq DNA Polymerase, kwa upungufu. Wakati wa upungufu, DNA polymerase inatumia dhahabu ya kwanza ya DNA kama template ya kuongeza dNTPs ya ziada hadi mwisho wa 3 'wa kila primer na kuzalisha sehemu ya DNA mbili iliyopangwa katika eneo la jeni la riba.
- Zawadi ambazo zimehifadhiwa kwa utaratibu wa DNA ambazo sio mechi halisi hazibakili annealed kwa digrii 72, hivyo kuzuia upungufu kwa jeni la riba.
Utaratibu huu wa kuthibitisha, kuunganisha na kupanua hurudiwa mara nyingi (30-40), kwa hivyo huongeza kwa kiasi kikubwa idadi ya nakala za gene iliyohitajika katika mchanganyiko. Ingawa mchakato huu ungekuwa unyenyekevu sana ikiwa unafanywa manually, sampuli zinaweza kutayarishwa na kuingizwa katika Thermocycler iliyopangwa, ambayo sasa ina kawaida katika maabara ya molekuli nyingi, na majibu kamili ya PCR yanaweza kufanywa katika masaa 3-4.
Kila hatua ya kuthibitisha imesimamisha mchakato wa upungufu wa mzunguko uliopita, na hivyo kuondokana na strand mpya ya DNA na kuiweka kwa wastani wa ukubwa wa jeni inayotaka.
Muda wa mzunguko wa elongation unaweza kufanywa kwa muda mrefu au mfupi kwa kutegemea ukubwa wa jeni la riba, lakini hatimaye, kupitia mizunguko ya mara kwa mara ya PCR, wengi wa templates watakuwa vikwazo kwa ukubwa wa gene ya maslahi peke yake, kama wao itakuwa imezalishwa kutoka kwa bidhaa za wote wawili.
Kuna mambo kadhaa tofauti ya PCR mafanikio ambayo yanaweza kutumiwa ili kuongeza matokeo. Njia inayotumiwa sana kwa kupima kwa uwepo wa bidhaa za PCR ni ugarose electrophoresis gel . Ambayo hutumiwa kutenganisha vipande vya DNA kulingana na ukubwa na malipo. Vipande vilivyoonyeshwa kwa kutumia rangi au radioisotopes.
Mageuzi
Tangu ugunduzi wa PCR, DNA polymerases zaidi ya Taq ya awali imegunduliwa. Baadhi ya haya yana uwezo bora "wa kupima ushahidi" au imara zaidi kwa joto la juu, na hivyo kuboresha ufanisi wa PCR na kupunguza makosa kutokana na kuingizwa kwa dNTP isiyo sahihi.
Vipengele vingine vya PCR vimeundwa kwa ajili ya maombi maalum na sasa vinatumiwa mara kwa mara katika maabara ya maumbile ya Masi. Baadhi ya haya ni PC-Real-Time PCR na Reverse-Transcriptase PCR. Ugunduzi wa PCR pia umesababisha maendeleo ya ufuatiliaji wa DNA, DNA fingerprinting na mbinu nyingine za Masi.